分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核(he)酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。
一、分光光度計原理
分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計采(cai)用一個可以產生多個波長的光(guang)(guang)源(yuan)，通過(guo)系列(lie)分(fen)光(guang)(guang)裝置，從(cong)(cong)而產生特定(ding)波長的光(guang)(guang)源(yuan)，光(guang)(guang)線透(tou)過(guo)測試的樣品(pin)(pin)后，部分(fen)光(guang)(guang)線被吸(xi)收，計算樣品(pin)(pin)的吸(xi)光(guang)(guang)值，從(cong)(cong)而轉化成樣品(pin)(pin)的濃(nong)度。樣品(pin)(pin)的吸(xi)光(guang)(guang)值與樣品(pin)(pin)的濃(nong)度成正比。
單色(se)(se)光輻(fu)射穿過被測物質(zhi)溶(rong)液(ye)時(shi)，被該物質(zhi)吸(xi)(xi)收(shou)的(de)(de)量與該物質(zhi)的(de)(de)濃(nong)度(du)(du)(du)和(he)液(ye)層的(de)(de)厚(hou)度(du)(du)(du)(光路長度(du)(du)(du))成(cheng)正比(bi)，其關系為(wei)(wei):A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc 式中(zhong):A 為(wei)(wei)吸(xi)(xi)光度(du)(du)(du);I。為(wei)(wei)入(ru)射的(de)(de)單色(se)(se)光強(qiang)度(du)(du)(du);I 為(wei)(wei)透射的(de)(de)單色(se)(se)光強(qiang)度(du)(du)(du);T 為(wei)(wei)物質(zhi)的(de)(de)透射率(lv);k 為(wei)(wei)摩爾吸(xi)(xi)收(shou)系數;L 為(wei)(wei)被分析物質(zhi)的(de)(de)光程(cheng)，即比(bi)色(se)(se)皿的(de)(de)邊長;c為(wei)(wei)物質(zhi)的(de)(de)濃(nong)度(du)(du)(du);
物(wu)質(zhi)對(dui)光的(de)選擇性吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)波長，以(yi)及相應的(de)吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)系數是該(gai)物(wu)質(zhi)的(de)物(wu)理常數。當已(yi)知某純物(wu)質(zhi)在(zai)一定(ding)條(tiao)件(jian)下的(de)吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)系數后(hou)可用同樣(yang)條(tiao)件(jian)將該(gai)供(gong)試(shi)品(pin)配成溶液，測(ce)定(ding)其吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)度(du),即可由上式(shi)計算(suan)出供(gong)試(shi)品(pin)中該(gai)物(wu)質(zhi)的(de)含(han)量。在(zai)可見光區，除某些物(wu)質(zhi)對(dui)光有(you)吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)外，很多物(wu)質(zhi)本身并沒有(you)吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)但可在(zai)一定(ding)條(tiao)件(jian)下加入顯色(se)(se)試(shi)劑(ji)或(huo)經過處理使(shi)其顯色(se)(se)后(hou)再(zai)測(ce)定(ding),故(gu)又(you)稱比色(se)(se)分析。由于顯色(se)(se)時(shi)影響呈色(se)(se)深淺的(de)因素(su)較多，且常使(shi)用單色(se)(se)光純度(du)較差的(de)儀器，故(gu)測(ce)定(ding)時(shi)應用標準品(pin)或(huo)對(dui)照品(pin)同時(shi)操作。
二、分光光度計使用方法步驟
1)預(yu)熱儀(yi)器。為使測(ce)定(ding)穩定(ding)，將(jiang)電源開(kai)關打開(kai)，使儀(yi)器預(yu)熱20min，為了防止光(guang)(guang)電管疲勞，不要連續(xu)光(guang)(guang)照。預(yu)熱儀(yi)器時和在不測(ce)定(ding)時應將(jiang)比色皿暗箱蓋(gai)打開(kai)，使光(guang)(guang)路切斷。
2)選(xuan)定波(bo)長(chang)。根據要(yao)求，轉動波(bo)長(chang)調節器，使指針指示所需要(yao)的單色光波(bo)長(chang)。
3)固定(ding)(ding)靈敏度(du)(du)檔(dang)(dang)。根據有色溶液對光(guang)的(de)吸收情況(kuang)，為使(shi)吸光(guang)度(du)(du)讀數為0.2-0.7，選擇合適(shi)的(de)靈敏度(du)(du)。為此，旋動(dong)靈敏度(du)(du)檔(dang)(dang)，使(shi)其固定(ding)(ding)于某(mou)一檔(dang)(dang)，在實驗(yan)過程中不再變動(dong)。一般測量固定(ding)(ding)在“1”檔(dang)(dang)。
4)調(diao)節“0”點。輕(qing)輕(qing)旋動調(diao)“0”電(dian)位器，使讀數表頭(tou)指針恰好位于透光(guang)度為“0”處(此時(shi)，比色皿暗箱(xiang)蓋是打開的，光(guang)路(lu)被切(qie)斷，光(guang)電(dian)管不受(shou)光(guang)照)。
5)調節T=100%。將盛蒸(zheng)餾水(或空白溶(rong)液(ye)或純溶(rong)劑)的比色皿(min)放入比色皿(min)座架中(zhong)的*格內(nei)，有色溶(rong)液(ye)放在(zai)其它(ta)格內(nei)，把比色皿(min)暗箱蓋子輕輕蓋上，轉(zhuan)動光量調節器，使(shi)透光度T=100%，即表頭指(zhi)針恰好指(zhi)在(zai)T=100%處。
6)測定。輕輕拉動(dong)比色皿座架(jia)拉桿，使有色溶(rong)液進入光路，此時(shi)表頭指針所示(shi)為(wei)該(gai)有色溶(rong)液的吸光度A。讀數后，打開比色皿暗箱(xiang)蓋。
7)關機。實驗(yan)完畢，切斷電源，將比(bi)色(se)皿取出洗凈，并將比(bi)色(se)皿座架及暗箱(xiang)用軟紙(zhi)擦凈。
三、分光光度計操作使用過程中的注意事項
1)為了防止光(guang)電管(guan)疲勞(lao)。不測定時必須將比色皿(min)暗箱蓋打開(kai)，使(shi)光(guang)路切斷，以延(yan)長光(guang)電管(guan)使(shi)用壽命。
2)比色皿的使用(yong)方法：
①拿比色皿時(shi)，手(shou)指只能捏住(zhu)比色皿的(de)毛玻璃面，不要碰比色皿的(de)透光面，以免沾污。
②清(qing)洗(xi)比色(se)皿(min)時，一般先用水沖(chong)洗(xi)，再(zai)用蒸餾水洗(xi)凈。如比色(se)皿(min)被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗(xi)滌(di)液(1∶2)浸泡片(pian)刻(ke)，再(zai)用水沖(chong)洗(xi)。不能用堿溶液或(huo)氧化性(xing)強(qiang)的(de)洗(xi)滌(di)液洗(xi)比色(se)皿(min)，以免(mian)損壞。也不能用毛刷清(qing)洗(xi)比色(se)皿(min)，以免(mian)損傷它的(de)透光面(mian)。
每(mei)次做(zuo)完實驗時，應立即(ji)洗凈(jing)比色皿。
③比色皿(min)外壁的(de)水用擦鏡紙(zhi)或(huo)細軟的(de)吸水紙(zhi)吸干，以保護透光面。
④測定(ding)有色(se)溶液(ye)吸(xi)光度時(shi)，一(yi)定(ding)要用有色(se)溶液(ye)洗比(bi)色(se)皿內壁幾次，以免改變有色(se)溶液(ye)的(de)(de)(de)濃度。另外，在測定(ding)一(yi)系列溶液(ye)的(de)(de)(de)吸(xi)光度時(shi)，通常都按(an)由稀到濃的(de)(de)(de)順序測定(ding)，以減(jian)小(xiao)測量(liang)誤(wu)差。
⑤在(zai)實際分(fen)析工作(zuo)中，通(tong)常根據(ju)溶液濃度的(de)(de)不同，選用液槽厚度不同的(de)(de)比色皿(min)，使溶液的(de)(de)吸光度控制在(zai)0.2～0.7。
四、分光光度計分操作中容易出現的幾個典型故障及其排除方法
1）儀器不能調零。可能原因:
①光門(men)不能*關閉。解(jie)決方法:修復光門(men)部件，使其*關閉。
②透(tou)過率(lv)"100%"旋到底了。解(jie)決(jue)方法(fa):重新(xin)調整(zheng)"100%"旋鈕。
③儀器嚴重(zhong)受潮。解決方法:可打開光電管暗盒，用電吹風(feng)吹上一會(hui)兒使(shi)其(qi)干燥(zao)，并更換(huan)干燥(zao)劑(ji)。
④電路(lu)(lu)故障(zhang)。解(jie)決方法:送(song)修理部門，檢修電路(lu)(lu)。
2)儀器(qi)不能調"100%"。可能原因(yin):
①光能量不夠。解(jie)決方法(fa):增加(jia)靈敏度倍率(lv)檔位(wei)，或更換光源燈(盡(jin)管燈還(huan)亮)。
②比色(se)皿架未落(luo)(luo)位。解決方法:調整比色(se)皿架使其落(luo)(luo)位。
③光電轉換部分(fen)老化(hua)。解決方法:更(geng)換部件。
④電(dian)路故障。解決方(fang)法(fa):調(diao)修電(dian)路。
3) 測量過程中(zhong),"100%"點經常(chang)變動。可能原(yuan)因:
①比色皿(min)(min)在比色皿(min)(min)架中放置的(de)位(wei)置不一(yi)致(zhi)，或其表(biao)面有液(ye)滴。解決方法:用擦(ca)(ca)鏡紙擦(ca)(ca)干凈比色皿(min)(min)表(biao)面，然后將其安放在比色槽的(de)左(zuo)邊，上面用定(ding)位(wei)夾定(ding)位(wei)。
②電路故障(電壓、光(guang)電接收(shou)、放(fang)大(da)電路)。解決(jue)方法:送修。
4)數顯不(bu)穩。可能原因:
①預(yu)熱(re)時(shi)間不夠。解決方(fang)法:延長預(yu)熱(re)時(shi)間至30分鐘(zhong)左右(部分儀器(qi)由(you)于老化等原因，長時(shi)間處于工作狀態時(shi)，也會工作不穩(wen))。
②光電(dian)管內(nei)的干(gan)(gan)燥劑失效(xiao)，使微電(dian)流放大器受潮。解決方法(fa):烘(hong)烤(kao)電(dian)路，并更換或烘(hong)烤(kao)干(gan)(gan)燥劑。
; ③環境振(zhen)動(dong)過大(da)、光源附近空氣流速大(da)、外(wai)界強光照射(she)等。解決方法:改善(shan)工作環境。
④光(guang)電管、電路等其它原因。解決(jue)方法:送修。
